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醛缩尿酸过多可导致痛风
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简介黄嘌呤氧化酶是体内尿酸生成的关键酶,它能催化次黄嘌呤和黄嘌呤转化为尿酸。尿酸过多可导致痛风。全球痛风发病率与日俱增,并呈年轻化趋势,成为第二大威胁人类生命和健康的代谢性疾病,因此研发防治痛风、高尿酸血 ...
黄嘌呤氧化酶是肉桂体内尿酸生成的关键酶,它能催化次黄嘌呤和黄嘌呤转化为尿酸。醛缩尿酸过多可导致痛风。氨基全球痛风发病率与日俱增,脲对并呈年轻化趋势,黄嘌化酶成为第二大威胁人类生命和健康的呤氧代谢性疾病,因此研发防治痛风、制作高尿酸血症的用研药物成为目前医药界的一个研究热点。XOD抑制剂可减少体内尿酸生成,肉桂预防痛风病。醛缩肉桂醛又称桂皮醛,氨基是脲对斯里兰卡肉桂油、桂皮油、黄嘌化酶藿香油、呤氧风信子油和玫瑰油等精油的制作重要活性成分。肉桂醛具有杀菌消毒、抗溃疡、抗病毒、抗癌等功能。有研究报道了肉桂挥发油和肉桂醛的体内降尿酸和血清XOD抑制实验,结果显示肉桂挥发油和肉桂醛具有较好的体内降尿酸活性,肉桂醛体外实验有XOD抑制活性。但活性比阳性药别嘌醇稍弱。另外,Maria等研究表明缩氨基脲类席夫碱类物质有较强的XOD抑制作用。基于肉桂醛与席夫碱均能抑制XOD,本研究采取基团拼合原理,合成肉桂醛缩氨基脲及缩氨基硫脲类席夫碱,并测定其对黄嘌呤氧化酶的抑制作用。探讨其构效关系,旨在筛选出高效低毒的黄嘌呤氧化酶的抑制剂。
1 材料与方法
1.1 实验材料
氧嗪酸钾盐、尿酸、黄嘌呤、别嘌呤醇、黄嘌呤氧化酶:均购自美国Sigma-A1drich公司;肉桂醛、4-甲基氨基硫脲、4-苯基氨基硫脲、氨基脲、氨基硫脲、Na2HP04·12H20、NaH2P04·2H20、氢氧化钠、EDTA、DMSO:均购自上海国药厂,分析纯;尿酸测定试剂盒:购自南京建成生物工程研究所,生产批号20180530;XOD测定试剂盒:购自南京建成生物工程研究所,生产批号20180720。
1.2 实验仪器
UV-2450紫外分光光度计:购自日本岛津公司;集热式恒温加热磁力搅拌器、精密电子天平BT25S:购自美国热电尼高力公司;旋转蒸发器RE52CS-1:购自上海亚荣生化仪器厂;循环水式多用真空泵SHB-Ⅲ:购自郑州长城科工贸有限公司;红外光谱仪FTIRNicolet5700、高分辨率四级杆-飞行时间质谱仪Agilent6538、核磁共振仪AV-600:均购自德国Bmker公司。
1.3 实验动物
健康雄性昆明种小鼠40只,体质量18~22g:由江西中医药大学实验动物科技中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(赣)2018-003。实验前饲养一周,以适应环境。饲养条件:室温(25±2)℃,相对湿度60%-70%。
1.4 实验方法
1.4.1 肉桂醛衍生物的合成
成将10mmol氨基脲或氨基硫脲类物质加入100mL三颈烧瓶中,准确加入15mL无水乙醇,加热磁力搅拌器中恒温70℃回流10min溶解,然后逐滴滴加10mmol的肉桂醛,溶液逐渐变为黄绿色,加4滴冰乙酸,回流4h后发现有固体析出,冷却至室温后过滤,重结晶,即可得到产物。其中化合物a是肉桂醛缩氨基脲,cinnamicaldehydesemicarbazone,CAS;化合物b是肉桂醛缩氨基硫脲,einnamaldehvdethiosemi-carbazide,CT;化合物c是肉桂醛缩甲基氨基硫脲,cinnamaldehvdeshrinkagemethylthiosemica曲azide,CSMT;化合物d是肉桂醛缩4-苯基氨基硫脲,cinnamaldehvdeshrinkagemethylthiosemicarbazide,CSMT(图1)。
1.4.2 合成化合物的结构表征
通过UV、IR、1H-NMR、ESI-MS进行结构表征。
UV光谱:将肉桂醛衍生物分别溶于无水乙醇.配成浓度为1×10-5m01/L的溶液,测定紫外-可见吸收光谱,测定波长为200-600nm。
IR光谱:将肉桂醛衍生物1mg和100mgKBr充分研磨后压片,在400~4000cm-1范围内,扫描32次,分辨率为4cm-1,测定肉桂醛衍生物的红外吸收光谱。
1H-NMR:样品10mg加入0.5mL氘代溶剂溶解。25℃条件下,配备5mmPABB0探针,在BrukerDRX400MHz波谱仪上进行测定。使用MestReNova软件处理数据。参数选择后采样、傅立叶变换、调相位、校正零点、积分、定最大最小值、打印图谱等步骤进行氢谱的测量。
ESI-MS质谱条件:ESI电喷雾离子源,负离子检测,离子源温度120℃。雾化器压力206850Pa,干燥气氮气流量7L/min,温度350℃。毛细管电压25kV,锥孔电压20V,锥孔气流量50L/h,检测电压l600V。用MassLvnx软件处理数据。
1.4.3 化合物对XOD酶抑制机理
1)酶活性测定
黄嘌呤氧化酶的作用下,黄嘌呤被氧化生成尿酸。实验方法参照Cos等的方法并略有修改。各化合物分别用DMSO溶解,制备样品液。黄嘌呤氧化酶水溶液(0.2U/mL)用超纯水配制,浓度为0.15mmol/L的黄嘌呤底物溶液用PBS缓冲溶液配制(pH7.5)。总反应体系3mL,先加入PBS缓冲溶液0.85mL,0.15mmol/L的黄嘌呤底物溶液2mL,再加入0.05mL不同浓度的样品溶液,混匀1分钟。然后加入0.1mL黄嘌呤氧化酶水溶液,立即摇匀,25℃水浴,于290nm处测定酶促反应曲线,每隔10s测一次吸光值,持续200s。黄嘌呤氧化酶的活性相当于曲线线性期部分的斜率。以样品浓度作横坐标,相对酶活作纵坐标,作图得到黄嘌呤氧化酶活性抑制曲线。重复测定3次。抑制率为:
抑制率(%)=((S0-S1)/S0)×100%
式中:S0是无样品组别的斜率,S1是添加样品组别的斜率。
2)肉桂醛缩氨基脲对XOD的抑制类型
以黄嘌呤为底物,研究肉桂醛缩氨基脲抑制黄嘌呤氧化酶活性的机理,即可逆抑制或者不可逆抑制。在测活体系中,固定底物黄嘌呤浓度,依次加入肉桂醛缩氨基脲浓度0、50、75、100μmo此,改变XOD酶的质量浓度,测定不同浓度的抑制剂肉桂醛缩氨基脲对XOD催化氧化黄嘌呤能力的影响。以酶促反应的速度对酶质量浓度作图,若得到一系列通过原点的直线,则为可逆抑制;若得到一组平行线,则为不可逆抑制。
3)肉桂醛缩氨基脲对XOD的抑制常
参照上述酶反应体系,以黄嘌呤为底物,研究肉桂醛缩氨基脲对黄嘌呤氧化酶活性的抑制常数。改变加入黄嘌呤的浓度,固定酶的浓度,测定不同浓度肉桂醛缩氨基脲(0、30、40、60μmol,L)抑制黄嘌呤氧化酶活性的效果。抑制类型由Lineweave-Burk双倒数作图法来判断。纵坐标是直线的斜率或Y轴的截距,横坐标是各化合物浓度,作图,可计算相应的抑制常数(KI或KIS)。
相关链接:肉桂醛,氨基脲,氢氧化钠,尿酸
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